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CCRF-CEM 人急性白血病T淋巴細(xì)胞
CCRF-CEM 人急性白血病T淋巴細(xì)胞
復(fù)蘇注意事項(xiàng)：
1）收到細(xì)胞后當(dāng)天換液，全部更換成客戶自己的新鮮培養(yǎng)基，放進(jìn)培養(yǎng)箱，第二天再消化。
2）邊觀察邊消化，根據(jù)細(xì)胞的形態(tài)，終止消化時(shí)間，采取以半分鐘間隔吹打細(xì)胞邊緣，
如可吹打下來，即終止消化?？蛻裘飨瘯r(shí)間。
3）隨細(xì)胞有一份細(xì)胞操作說明書，請客戶仔細(xì)查看。
4）記得加1%雙抗，降低被污染的概率。另外盡早凍存留種，以備后用。
5）售后時(shí)間為一周，僅限于細(xì)胞本身的質(zhì)量問題，而因乙方自己不當(dāng)操作（不規(guī)范操作，消化過度，不加雙抗導(dǎo)致的污染等）導(dǎo)致的細(xì)胞問題不在售后范疇。
6）收到細(xì)胞后，如細(xì)胞狀態(tài)不佳，或培養(yǎng)中遇到問題，煩請當(dāng)天盡快聯(lián)系，以便處理。當(dāng)天及時(shí)反饋細(xì)胞情況和細(xì)胞照片是售后跟蹤處理重要的參考依據(jù)，請您務(wù)必重視。
7）剛收到細(xì)胞時(shí)，胎牛血清可以用15%培養(yǎng)兩三天，利于細(xì)胞盡快恢復(fù)狀態(tài)，細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后，再調(diào)回10%即可。
（其中1，2條針對于貼壁細(xì)胞，懸浮細(xì)胞詳請請見細(xì)胞操作說明書）
服務(wù)注意事項(xiàng)：
一）客戶收到細(xì)胞先不開蓋，瓶身擦拭酒精后放在培養(yǎng)箱靜置2-3小時(shí)（看細(xì)胞密度而定），接著在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，并對細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照（建議收細(xì)胞時(shí)就整體外觀拍一張照片，觀察培養(yǎng)基的顏色和是否有漏液情況，隨后在顯微鏡下拍下細(xì)胞狀態(tài)，100X，200X 各一張），觀察細(xì)胞在運(yùn)輸過程中是否有污染情況；
注意：細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液為我們公司贈(zèng)品。收到細(xì)胞后，把培養(yǎng)方瓶里的培養(yǎng)基收集放置于4℃?zhèn)溆谩傞_始培養(yǎng)時(shí)，建議用我們寄過去的培養(yǎng)基，補(bǔ)加2%的血清，待細(xì)胞狀態(tài)恢復(fù)后，培養(yǎng)液一半用我們的培養(yǎng)基，一半用你們的，起個(gè)過渡作用，以免細(xì)胞不適應(yīng)而造成生長不好。
細(xì)胞培養(yǎng)常見問題分析
細(xì)胞培養(yǎng)
1、冷凍管應(yīng)如何解凍？
取出冷凍管后， 須立即放入37 ℃水槽中快速解凍， 輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化， 并注意水面不可超過冷凍管蓋沿， 否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時(shí)， 必須注意安全， 預(yù)防冷凍管之爆裂。
2、細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時(shí)， 是否應(yīng)馬上去除DMSO？
除少數(shù)特別注明對DMSO 敏感之細(xì)胞外， 絕大部分細(xì)胞株（包括懸浮性細(xì)胞）， 在解凍之后， 應(yīng)直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中， 待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無法生長或貼附之問題。
3、可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基？
不能。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)之細(xì)胞培養(yǎng)基， 若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基， 細(xì)胞大都無法立即適應(yīng)， 造成細(xì)胞無法存活。
4、可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之血清種類？
不能。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個(gè)極為重要的營養(yǎng)來源， 所以血清的種類和品質(zhì)對于細(xì)胞的生長會(huì)產(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清， 在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯(cuò)誤常會(huì)造成細(xì)胞無法存活。
5、何謂FBS, FCS, CS, HS ?
FBS （fetal bovine serum） 和FCS （fetal calf serum） 是相同的意思， 兩者都是指胎牛血清， FCS 乃錯(cuò)誤的使用字眼， 請不要再使用。CS （calf serum） 則是指小牛血清。HS （horseserum） 則是指馬血清。
6、培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)使用5 % 或10% CO2？或根本沒有影響？
一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統(tǒng)， 而培養(yǎng)基中NaHCO3 的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用的CO2 濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用10 % CO2；當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時(shí)， 則應(yīng)使用5 % CO2 培養(yǎng)細(xì)胞。
7、何時(shí)須更換培養(yǎng)基？
視細(xì)胞生長密度而定， 或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時(shí)間，按時(shí)更換培養(yǎng)基即可。
8、培養(yǎng)基中是否須添加抗生素？
除于特殊篩選系統(tǒng)中外， 一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下， 培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。
9、附著性細(xì)胞繼代時(shí)所使用之trypsin-EDTA 濃度？應(yīng)如何處理？
一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中， 保存于–20 ℃，避免反復(fù)冷凍解凍造成trypsin 之活性降低， 并可減少污染之機(jī)會(huì)。
10、懸浮性細(xì)胞應(yīng)如何繼代處理？
一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中， 稀釋細(xì)胞濃度即可， 若培養(yǎng)液太多時(shí)， 可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高， 直到無法容納為止。分瓶時(shí)取出一部份含細(xì)胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶， 加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度， 重復(fù)前述步驟即可。
11、欲將一般動(dòng)物細(xì)胞離心下來，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速？
欲回收動(dòng)物細(xì)胞， 其離心速率一般為300xg （約1,000rpm），5 - 10 分鐘， 過高之轉(zhuǎn)速， 將造成細(xì)胞死亡。
12、細(xì)胞之接種密度為何？
依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無法生長之一重要原因。
13、細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何？
動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存時(shí)*常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5 - 10 %DMSO （dimethyl sulfoxide） 和90 - 95 % 原來細(xì)胞生長用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于DMSO 稀釋時(shí)會(huì)放出大量熱能， 故不可將DMSO 直接加入細(xì)胞液中， 必須使用前先行配制完成。
14、DMSO 之等級和無菌過濾之方式為何？
冷凍保存使用之DMSO 等級， 必須為Tissue culture grade之DMSO （如Sigma D2650）， 其本身即為無菌狀況， 次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中， 保存于4°C， 避免反復(fù)冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質(zhì)， 并可減少污染之機(jī)會(huì)。若要過濾DMSO， 則須使用耐DMSO 之Nylon 材質(zhì)濾膜。
15、冷凍保存細(xì)胞之方法？
冷凍保存方法一: 冷凍管置于4℃ 30~60 分鐘→ （-20 ℃30 分鐘*） → -80 ℃16~18 小時(shí)（或隔夜） → 液氮槽vaporphase 長期儲(chǔ)存。
冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機(jī)中每分鐘降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下， 再放入液氮槽vapor phase長期儲(chǔ)存。*-20 ℃不可超過1 小時(shí)， 以防止冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃ 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
15、細(xì)胞欲冷凍保存時(shí)， 細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度？
冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為1x106 cells/ml vial， 融合瘤細(xì)胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。
16、應(yīng)如何避免細(xì)胞污染？
細(xì)胞污染的種類可分成細(xì)菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因?yàn)闊o菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細(xì)胞等。嚴(yán)格之無菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細(xì)胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染之方法。
17、如果細(xì)胞發(fā)生微生物污染時(shí)，應(yīng)如何處理？
加入相應(yīng)抗生素。直接滅菌后丟棄之。
18、支原體（mycoplasma） 污染的細(xì)胞， 是否能以肉眼觀察出異狀？
不能。除極有經(jīng)驗(yàn)之專家外，大多數(shù)遭受支原體污染的細(xì)胞株，無法以其外觀分辨之。
19、支原體污染會(huì)對細(xì)胞培養(yǎng)有何影響？
支原體污染幾乎可影響所有細(xì)胞之生長參數(shù)， 代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，必須確認(rèn)細(xì)胞為mycoplasma-free，實(shí)驗(yàn)結(jié)果之?dāng)?shù)據(jù)方有意義。
20、CO2 培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔？
定期（至少每兩周一次） 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。
21、為何培養(yǎng)基保存于4 ℃ 冰箱中， 顏色會(huì)偏暗紅色， 且pH值會(huì)越來越偏堿性？
培養(yǎng)基保存于4 ℃ 冰箱中， 培養(yǎng)基內(nèi)之CO2 會(huì)逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性。而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑（通常為phenol red） 的顏色也會(huì)隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿之結(jié)果， 將造成細(xì)胞生長停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時(shí)， 可以通入無菌過濾之CO2， 以調(diào)整pH 值。
22、各種細(xì)胞培養(yǎng)用的dish，flask是否均相同？
不同廠牌的dish 或flask， 其所coating 的polymer 不同， 制造程序亦不同， 雖對大部分細(xì)胞沒有太大之影響， 惟少數(shù)細(xì)胞則可能因使用廠牌不同之dish 或flask 而有顯著之生長差異。
23、購買之細(xì)胞冷凍管經(jīng)解凍后，為何會(huì)發(fā)生細(xì)胞數(shù)目太少之情形？ 購買之細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活率不佳可能原因？
研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)存活率不佳， 常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯(cuò)誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。血清使用錯(cuò)誤或血清的品質(zhì)不佳。解凍過程錯(cuò)誤。冷凍細(xì)胞解凍后， 加以洗滌細(xì)胞和離心。懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞。培養(yǎng)溫度使用錯(cuò)誤。細(xì)胞置于–80℃太久。
24、收到之冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋，或瓶蓋脫落之原因？
冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂，可能是因?yàn)椴僮髡邐A取冷凍管時(shí)用力不當(dāng)，造成冷凍管裂損，建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動(dòng)或松脫，乃因熱脹冷縮之物理現(xiàn)象，冷凍管有可能因此而造成細(xì)胞污染，故冷凍管于放入和取出液氮桶時(shí)，均應(yīng)立刻將冷凍管再一次扭緊 。
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