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細胞培養(yǎng)常見問題及解答

發(fā)布日期: 2022-12-12
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1. 如何選用特殊細胞系培養(yǎng)基?


培養(yǎng)某一類型細胞沒有固定的培養(yǎng)條件。在MEM中培養(yǎng)的細胞,很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長??傊?,shouxuanMEM做粘附細胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細胞培養(yǎng)是一個好的開始。


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2. 何時須更換培養(yǎng)基?


視細胞生長密度而定,或遵照細胞株基本數據上的更換時間,按時更換培養(yǎng)基即可。


3. 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基?


不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應的細胞培養(yǎng)基,若驟然使用和原先提供的培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基,細胞大都無法立即適應,造成細胞無法存活。


4. 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同的血清種類?


不能。血清是細胞培養(yǎng)上一個極為重要的營養(yǎng)來源,所以血清的種類和品質對于細胞的生長會產生極大的影響。來自不同物種的血清,,在一些物質或分子的量或內容物上都有所不同,血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。


5. 何謂FBS, FCS, CS, HS ?


FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思,兩者都是指胎牛血清,FCS是錯誤的使用字眼,請不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。


杭州仟諾生物科技有限公司常備優(yōu)質胎牛血清。


6. 培養(yǎng)細胞時應使用5% 或10% CO2?或根本沒有影響?


一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO3 2-/H+ 作為pH 的緩沖系統(tǒng),而培養(yǎng)基中NaHCO3 的含量將決定細胞培養(yǎng)時應使用的CO2 濃度。當培養(yǎng)基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時,細胞培養(yǎng)時應使用10% CO2;當培養(yǎng)基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時,則應使用5% CO2 培養(yǎng)細胞。


7.Hank's 平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用,不需要CO2培養(yǎng)。原因是什么?Hank's 平衡鹽溶液(HBS)和Earle's平衡鹽溶液(EBS)有什么本質的功能差別?


HBS和EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在Eagles (2.2 g/L)中比在Hanks (0.35 g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡,以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中,溶液會變堿,Hanks液在CO2培養(yǎng)箱中會變酸。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組織,需要用Eagles液,如果僅僅是清洗將要在細胞培養(yǎng)基中儲存的組織,用Hanks液就可以了。


8. 什么是細胞的接種密度?


依照細胞株基本數據上的接種密度或稀釋分盤的比例接種即可。細胞數太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長之一重要原因。


9. 懸浮性細胞應如何繼代處理?


一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中,稀釋細胞濃度即可,若培養(yǎng)液太多時,可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高,直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細胞的培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶,加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當濃度,重復前述步驟即可。


10. 冷凍管應如何解凍?


取出冷凍管后,須立即放入37℃水槽中快速解凍,輕搖冷凍管使其在1 分鐘內全部融化,并注意水面不可超過冷凍管蓋沿,否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時,必須注意安全,預防冷凍管之爆裂。


11. 細胞冷凍管解凍培養(yǎng)時, 是否應馬上去除DMSO?


除少數特別注明對DMSO 敏感的細胞外,絕大部分細胞株(包括懸浮性細胞),在解凍之后,應直接放入含有10-15 ml新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)角瓶中,待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO 即可,如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附的問題。


12. 附著性細胞繼代時所使用的trypsin-EDTA 濃度?應如何處理?


一般使用的trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53 mM EDTA Na4。第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中,保存于-20 ℃,避免反復冷凍解凍造成trypsin 的活性降低,并可減少污染的機會。


13. 欲將一般動物細胞離心下來,其離心速率應為多少轉速?


回收動物細胞,其離心速率一般為300xg (約1 000 rpm),5-10 分鐘,過高的轉速,將造成細胞死亡。


14. 細胞冷凍培養(yǎng)基的成份為何?


動物細胞冷凍保存時最常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5-10% DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90-95% 原來細胞生長用的新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意:由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能,故不可將DMSO 直接加入細胞液中,必須使用前先行配制完成。


15. DMSO 的等級和無菌過濾的方式為何?


冷凍保存使用的DMSO 等級,必須為Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650),其本身即為無菌狀況,第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中,保存于4℃,避免反復冷凍解凍造成DMSO 的裂解而釋出有害物質,并可減少污染的機會。若要過濾DMSO,則須使用耐DMSO 的Nylon 材質濾膜。


Sigma D2650,杭州仟諾生物科技有限公司常備現貨,現貨直發(fā)


16. 冷凍保存細胞的方法?


冷凍保存方法一:冷凍管置于4℃ 30~60 分鐘→ (-20℃ 30 分鐘*) → -80℃16~18 小時(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長期儲存。


冷凍保存方法二:冷凍管置于已設定程序的可程序降溫機中每分鐘降1-3 ℃至-80℃以下,再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20℃不可超過1 小時,以防止冰晶過大,造成細胞大量死亡,亦可跳過此步驟,接放入-80℃冰箱中,惟存活率稍微 降低一些。


17. 細胞欲冷凍保存時, 細胞冷凍管內應有多少細胞濃度?


冷凍管內細胞數目一般為1x106 cells/ml vial,融合瘤細胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。


18.培養(yǎng)基中是否須添加抗生素?


除于特殊篩選系統(tǒng)中外,一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下,培養(yǎng)基中不應添加任何抗生素。


19. 應如何避免細胞污染?


細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因為無菌操作技術不當、操作室環(huán)境不佳、污染的血清和污染的細胞等。嚴格的無菌操作技術、清潔的環(huán)境、與品質良好的細胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染的最好方法。當然,適當添加抗生素也是防止細胞污染的途徑


20. 如果細胞發(fā)生微生物污染時,應如何處理?


原則上:直接滅菌后丟棄之。


當重要的培養(yǎng)污染時,研究者可能試圖消除或控制污染。首先,確定污染物是細菌、真菌、支原體或酵母,把污染細胞與其它細胞系隔離開,用實驗室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺,檢查HEPA過濾器。


高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性,因而,做劑量反應實驗確定抗生素和抗霉菌素產生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如liangxing霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實驗步驟。


(1) 在無抗生素的培養(yǎng)基中消化、計數和稀釋細胞,稀釋到常規(guī)細胞傳代的濃度。


(2) 分散細胞懸液到多孔培養(yǎng)板中,或幾個小培養(yǎng)瓶中。在一個濃度梯度范圍內,把選擇抗生素加入到每一個孔中。例如,liangxing霉素B推薦下列濃度,0.25,0.50,1.0,2.0,4.0,8.0 mg/ml。


(3) 每天觀測細胞毒性指標,如脫落,出現空泡,匯合度下降和變圓。


(4) 確定抗生素毒性水平后,使用低于毒性濃度2~3倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞2~3代。


(5) 在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞一代。


(6) 重復步驟4。


(7) 在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4~6代,確定污染是否以已被消除。


21. 支原體(mycoplasma) 污染的細胞, 是否能以肉眼觀察出異狀?


不能。除極有經驗之專家外,大多數遭受支原體污染的細胞株,無法以其外觀分辨之。


22. 支原體污染會對細胞培養(yǎng)有何影響?


支原體污染幾乎可影響所有細胞的生長參數,代謝及研究的任一數據。故進行實驗前,必須確認細胞為mycoplasma-free,實驗結果的數據方有意義。


23. 偵測出細胞株有支原體污染時, 該如何處理?


直接滅菌后丟棄,以避免污染其它細胞株,但是如果您的樣本珍貴,建議您使用支原體去除試劑去除污染


24. CO2 培養(yǎng)箱的水盤如何保持清潔?


定期(至少每兩周一次) 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。


25. 為何培養(yǎng)基保存于4℃ 冰箱中, 顏色會偏暗紅色,且pH值會越來越偏堿性?


培養(yǎng)基保存于4℃冰箱中,培養(yǎng)基內的CO2會逐漸溢出,造成培養(yǎng)基越來越偏堿性。而培養(yǎng)基中的酸堿指示劑(通常為phenol red) 的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿的結果,將造成細胞生長停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時,可以通入無菌過濾的CO2,以調整pH 值。


26. 各種細胞培養(yǎng)用的dish,flask是否均相同?


不同廠牌的dish 或flask,其所coating 的polymer 不同,制造程序亦不同,雖對大部分細胞沒有太大之影響,惟少數細胞則可能因使用廠牌不同的dish 或flask 而有顯著的生長差異。


27. 購買的細胞冷凍管經解凍后,為何會發(fā)生細胞數目太少的情形?


研究人員在冷凍細胞的培養(yǎng)時出現細胞數目太少,大都是因為離心過程操作上的失誤,造成細胞的物理性損傷,以及細胞流失。建議細胞解凍后不要立刻離心,應待細胞生長隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。


28. 購買的細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因?


研究人員在細胞培養(yǎng)時出現存活率不佳,常見原因可歸納為:培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質不佳。血清使用錯誤或血清的品質不佳。解凍過程錯誤。冷凍細胞解凍后,加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認為死細胞。培養(yǎng)溫度使用錯誤。細胞置于-80℃太久。


29. 如何避免沉淀物的產生?


我們建議您在使用血清的時候,注意下列的操作:


(1) 解凍血清時,請按照所建議的逐步解凍法(-20℃至4℃至室溫),若血清解凍時改變的溫度太大(如-20℃至37℃),非常容易產生沉淀物。


(2) 解凍血清時,請隨時將之搖晃均勻,使溫度及成分均一,減少沉淀的發(fā)生。


(3) 請勿將血清置于37℃太久。若在37℃放置太久,血清會變得混濁,同時血清中許多較不穩(wěn)定的成分也會因此受到損害,而影響血清的質量。


(4) 血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多,若非必要,可以無須做此步驟。


(5) 若必須做血清的熱滅活,請遵守56℃,30分鐘的原則,并且隨時搖晃均勻。溫度過高,時間過久或搖晃不均勻,都會造成沉淀物的增多。


30. L-谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)中重要嗎?它在溶液中不穩(wěn)定嗎?


L-谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)時是重要的。脫掉氨基后,L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細胞的能量來源、參與蛋白質的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經過一段時間后會降解,但是確切的降解率一直沒有最終定論。L-谷氨酰胺的降解導致氨的形成,而氨對于一些細胞具有毒性。


31. GlutaMAX-I是什么?培養(yǎng)細胞如何利用GlutaMAX-I?這個二肽有多穩(wěn)定?


GlutaMAX-I 二肽是一個L-谷氨酰胺的衍生物,其不穩(wěn)定的alpha-氨基用L-丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽,釋放L-谷氨酰胺供利用。


GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定,即使在121℃滅菌20分鐘,GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解,如果在相同條件下,L-谷氨酰胺幾乎wanquan降解。


32. 什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅?


酚紅在培養(yǎng)基中用作PH值的指示劑:中性時為紅色,酸性時為黃色,堿性時為紫色。研究表明,酚紅可以模擬固醇類激素的作用,(特別是雌激素)。為避免固醇類反應,培養(yǎng)細胞,尤其是哺乳類細胞時,不用加。


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