操作規(guī)程

一、復(fù)蘇

1、事先用Matrix進(jìn)行培養(yǎng)皿/板的包被處理。平時Matrix保存在-20℃，使用之前放在4℃冰箱或冰上進(jìn)行解凍。待Matrix解凍后，按1：100的比例迅速用PBS液體稀釋。按6孔板每孔加1ml，150px皿加2ml，250px皿加3ml的量加入，加入后迅速搖動皿/板，使加入的Matrix*覆蓋整個皿底。放到37℃培養(yǎng)箱中4小時，使用前去掉包被液（如果暫時不使用，用封口膜密封，在4℃冰箱能保存一周）。

2、復(fù)蘇前準(zhǔn)備iCell解凍*培養(yǎng)基（iCell解凍液基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及iCell解凍液添加劑）。加入適量的解凍液（6孔板每孔加2ml，150px皿加3ml，250px皿加9ml），另加入10ug/ml的Y27632因子，放入37℃培養(yǎng)箱中。

3、復(fù)蘇一支細(xì)胞用5ml的上述混合培養(yǎng)基，復(fù)蘇之前要在37℃水浴鍋里充分預(yù)熱。從液氮罐里取出凍存管后，迅速轉(zhuǎn)移到生物安全柜中（如果液氮罐的位置距離安全柜遠(yuǎn)，要用裝有液氮的容器把凍存管轉(zhuǎn)移到安全柜），并用加熱好的*培養(yǎng)基進(jìn)行解凍（用移液槍不停的往凍存管中打入—抽出培養(yǎng)基，交換溶解開的細(xì)胞，直至*溶解）。

4、200Xg離心5分鐘，去掉上清液，加入1ml的iCell*解凍培養(yǎng)基（含10ug/ml的Y27632因子），用手指彈碎管內(nèi)沉淀。按接種到每孔板/皿1ml的量，補(bǔ)充iCell*解凍培養(yǎng)基到離心管中，輕輕吹吸三四次后加入培養(yǎng)皿/板中。水平十字振動使細(xì)胞均勻分布，5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。

5、24小時后換成iCell*培養(yǎng)基（iCell基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及iCell基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加劑）。以后每隔22—24小時換液。細(xì)胞長滿80-90%需要傳代或凍存。

二、傳代/凍存
1、傳代前要進(jìn)行培養(yǎng)皿/板的包被處理，做法與復(fù)蘇時相同。培養(yǎng)基為iCell*培養(yǎng)基，同時加入10ul/ml的Y27632因子。

2、傳代/凍存前，準(zhǔn)備37℃預(yù)熱好的無鈣鎂離子PBS溶液及傳代工作液（0.5mM EDTA+0.025%胰酶）。

3、吸走iCell*培養(yǎng)基，并加入37℃預(yù)熱好的PBS溶液清洗二次。

4、加入適量（按6孔板每孔加1ml，150px皿加2ml，250px皿加3ml的量）的37℃預(yù)熱好的傳代工作液。

5、37℃放置4-5分鐘（前一分鐘過后拿出來，用手指輕彈幾下板/皿的底部），顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣開始脫離培養(yǎng)皿/板底，克隆內(nèi)部大部分細(xì)胞間出現(xiàn)間隙但尚未相互分離，肉眼觀察到細(xì)胞集落變得不透明且發(fā)白，表明細(xì)胞消化時間理想。

6、迅速吸去傳代液，加入適量的iCell*培養(yǎng)基終止消化，用移液器扇形吹打皿/板底部（吹打不用超過10次），使附著的細(xì)胞集落脫落。（如果消化時間不當(dāng)，致使細(xì)胞*從皿/板底剝離的情況，不用吸出傳代液，加入同等量的iCell*培養(yǎng)基終止消化）。

7、移入離心管，離心后重懸。傳代比例為1：8—1：12；凍存按6孔板每孔凍1支，150px皿凍2-4支，250px皿凍6-12支。每支加入0.8ml的90%iCell*培養(yǎng)基與10%的DMSO。

8、復(fù)蘇時按凍存前的1：4—1：6的比例進(jìn)行。

注意事項
1、每次換液時要觀察細(xì)胞生長狀況以及細(xì)胞形態(tài)的變化并對細(xì)胞進(jìn)行拍照，但是在培養(yǎng)箱外操作的時間不要過長，避免因溫度對細(xì)胞生長狀態(tài)造成不利影響。

2、更換培養(yǎng)基之前，要對新的培養(yǎng)基進(jìn)行37℃預(yù)熱。為了避免反復(fù)加熱培養(yǎng)基而造成的培養(yǎng)基中各種成分的影響，只對本次要更換的量進(jìn)行預(yù)熱處理。

3、用移液器吹打細(xì)胞，因為移液管的端部較為圓滑，對細(xì)胞傷害的程度小于用1ml的槍。

4、細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時要及時傳代，否則會造成細(xì)胞形態(tài)的變化。但是，如果細(xì)胞在鋪板時混合不均勻，而形成部分集落過大的情況，即使沒有達(dá)到80-90%也要進(jìn)行傳代。