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懸浮細(xì)胞的傳代與培養(yǎng)

發(fā)布日期: 2019-05-17
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懸浮細(xì)胞的傳代

      

              懸浮細(xì)胞傳代比貼壁細(xì)胞傳代稍微簡單一些。由于細(xì)胞已經(jīng)在生長培養(yǎng)基中的懸浮,因此無需通過酶的作用使其從培養(yǎng)容器表面脫離,整個(gè)過程較為迅速,對細(xì)胞的損傷也較小。懸浮培養(yǎng)時(shí)不進(jìn)行生長培養(yǎng)基的更換;而是每2到3天加料一次,直到細(xì)胞匯合??梢灾苯釉谂囵B(yǎng)瓶中稀釋細(xì)胞,然后繼續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增,或者也可以從培養(yǎng)瓶中取出一部分細(xì)胞,將余下的細(xì)胞稀釋到該細(xì)胞系適宜的接種密度。懸浮細(xì)胞的傳代后的延滯期一般比貼壁細(xì)胞要短。

 

 

 

懸浮細(xì)胞培養(yǎng)容器

 

              懸浮培養(yǎng)可采用未經(jīng)組織培養(yǎng)處理的無菌培養(yǎng)瓶(例如:不嗲折流板的搖瓶)進(jìn)行;但是,專為懸浮細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)瓶(攪拌瓶具有出色的氣體交換功能,可進(jìn)行較大規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)。

 

             轉(zhuǎn)瓶有兩種基本設(shè)計(jì);其培養(yǎng)基由懸掛的攪拌棒或者垂直的葉輪攪拌(即攪動)。垂直葉輪的換氣效果更佳。轉(zhuǎn)瓶總培養(yǎng)體積不能超過轉(zhuǎn)瓶標(biāo)示體積的一半,以便換氣充分(例如:500ml轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)液體不能超過250ml)。  

 

 

所需材料     

  1. 裝有懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)容器
  2.  不帶折流板的搖瓶或者轉(zhuǎn)瓶
  3. *生長培養(yǎng)基,預(yù)熱至37℃
  4. 37℃培養(yǎng)箱,充有二氧化碳濃度為5%的濕化空氣
  5. 磁力攪拌盤(如果使用轉(zhuǎn)瓶)、滾架(如果使用滾瓶)或者搖床(如果使用傳統(tǒng)培養(yǎng)瓶或者培養(yǎng)皿)
  6. 用于活細(xì)胞和總細(xì)胞計(jì)數(shù)的試劑和設(shè)備(例如:countess™||自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀、臺盼藍(lán)染料或血球計(jì)數(shù)器。)

 

 

 

懸浮細(xì)胞傳代流程

 

             所有與細(xì)胞接觸的溶液和設(shè)備均應(yīng)為無菌狀態(tài)。必須采用正確的無菌技術(shù),并且在層流通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行。傳代應(yīng)在細(xì)胞處于對數(shù)期、未達(dá)到匯合狀態(tài)時(shí)進(jìn)行。達(dá)到匯合狀態(tài)時(shí),懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞會聚集成團(tuán)塊,轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶時(shí)培養(yǎng)基會變得渾濁。傳代前所建議的大細(xì)胞密度隨細(xì)胞系不同而有所差異。

 

            使用搖瓶進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)

                                   以下實(shí)驗(yàn)方案介紹了利用振蕩培養(yǎng)箱和搖瓶進(jìn)行哺乳動物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時(shí)傳代的一般流程。詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方案,必須參閱針對具體的產(chǎn)品說明書。

注:應(yīng)確保搖瓶中無折流板(即:位于培養(yǎng)瓶底部用于攪動的齒形板),因?yàn)檎哿靼鍟茐膿u動節(jié)奏。

  1. 當(dāng)細(xì)胞適合傳代(即:處于對數(shù)生長期未達(dá)到匯合狀態(tài))時(shí),從培養(yǎng)箱取出培養(yǎng)瓶,使用無菌吸管從培養(yǎng)瓶中取出少量細(xì)胞樣品。如果吸取樣品前細(xì)胞已經(jīng)沉淀,應(yīng)轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶,使細(xì)胞在培養(yǎng)基中均勻分布。
  2. 通過此樣品,采用countess™||自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀或者血球計(jì)數(shù)器、細(xì)胞計(jì)數(shù)儀按照臺盼藍(lán)拒染法測定總細(xì)胞數(shù)和活細(xì)胞百分比。
  3. 計(jì)算將細(xì)胞稀釋到推薦接種密度時(shí)需要加入的培養(yǎng)基體積
  4. 在無菌狀態(tài)下將適量預(yù)熱的生長培養(yǎng)基加入到培養(yǎng)瓶中。必要時(shí)可將培養(yǎng)的細(xì)胞分到多個(gè)培養(yǎng)瓶中。
  5. 將培養(yǎng)瓶的瓶蓋旋開一圈,以便進(jìn)行充分的氣體交換(或者使用透氣性瓶蓋),并將培養(yǎng)瓶放回振蕩培養(yǎng)箱。搖晃速度取決于具體的細(xì)胞系。

 

      注:為了盡量減少細(xì)胞碎片和無用的代謝副產(chǎn)物在振蕩培養(yǎng)體系中蓄積,每三周(或者必要時(shí))應(yīng)將細(xì)胞懸液輕輕離心一次,離心力為100×g,時(shí)間為5-10分鐘,然后用新鮮的生長培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞沉淀。

 

       使用轉(zhuǎn)瓶進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)

 以下實(shí)驗(yàn)方案介紹了利用轉(zhuǎn)瓶進(jìn)行哺乳動物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時(shí)傳代的一般流程。詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方案,必須參閱針對具體的產(chǎn)品說明書。

     請注意細(xì)胞對物理剪切作用很敏感。應(yīng)確保葉輪可自由轉(zhuǎn)動,不會觸碰到容器壁或底部。葉片頂部應(yīng)稍微高于培養(yǎng)基。以確保培養(yǎng)系統(tǒng)換氣充分。調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)動裝置,使葉片不會觸碰容器和底部。下表列出了不同尺寸轉(zhuǎn)瓶所需的小培養(yǎng)基體積。

 

                    

 

我們建議開始旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)時(shí)轉(zhuǎn)瓶容器不要超過500ml。建議從方法成熟、體積較小的轉(zhuǎn)瓶開始逐步擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模。

 

  1. 當(dāng)細(xì)胞適合傳代(即:處于對數(shù)生長期而未達(dá)到匯合狀態(tài))時(shí),從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)瓶,使用無菌吸管從培養(yǎng)瓶中取出少量細(xì)胞樣品。如果吸取樣品前細(xì)胞已經(jīng)沉淀,應(yīng)轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶,使細(xì)胞在培養(yǎng)基中均勻分布。
  2. 通過此樣品,采用countess™||自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀或者血球計(jì)數(shù)器、細(xì)胞技術(shù)儀按照臺盼藍(lán)拒染法測定總細(xì)胞和活細(xì)胞百分比。
  3. 計(jì)算將細(xì)胞稀釋到推薦接種密度時(shí)需要加入的培養(yǎng)基體積
  4. 在無菌狀態(tài)下將適量預(yù)熱的生長培養(yǎng)基加入到培養(yǎng)瓶中。必要時(shí)可將培養(yǎng)的細(xì)胞分到多個(gè)培養(yǎng)瓶中
  5. 將培養(yǎng)瓶的瓶蓋旋開一圈,以便進(jìn)行充分的氣體交換,并將培養(yǎng)瓶放回培養(yǎng)箱。轉(zhuǎn)速取決于所用細(xì)胞系和葉輪類型。應(yīng)確保轉(zhuǎn)速始終在推薦值范圍內(nèi),以免剪切應(yīng)力導(dǎo)致細(xì)胞損傷。

 

注:為了盡量減少細(xì)胞碎片和無用的代謝副產(chǎn)物在振蕩培養(yǎng)體系中蓄積,每三周(或者必要時(shí))應(yīng)將細(xì)胞懸液輕輕離心一次,離心力為100×g,時(shí)間為5-10分鐘,然后用新鮮的生長培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞沉淀。

 

懸浮昆蟲細(xì)胞傳代的注意事項(xiàng)

 

                     雖然昆蟲細(xì)胞傳代的一般步驟與哺乳動物細(xì)胞相同,但是這些培養(yǎng)系統(tǒng)的一些關(guān)鍵要求有所不同。為了獲得滿意結(jié)果,實(shí)驗(yàn)中必須嚴(yán)格遵守所用昆蟲細(xì)胞系附帶的操作說明。

  1. 進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時(shí)無需更換培養(yǎng)基。定期傳代時(shí)需要吸出細(xì)胞懸液,然后加入適量培養(yǎng)基,將細(xì)胞稀釋到適當(dāng)密度。添加新鮮培養(yǎng)基后可使細(xì)胞營養(yǎng)素達(dá)到*補(bǔ)充。
  2. 培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞時(shí)建議不要用二氧化碳交換。
  3. 昆蟲細(xì)胞應(yīng)于27℃、非濕化環(huán)境中培養(yǎng)。可將細(xì)胞放在操作臺上或者放入抽屜中于室溫下培養(yǎng)。但是,建議使用溫度控制在27℃的環(huán)境。
  4. 使用昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng)基。
  5. 使用表面活性劑降低剪切作用。進(jìn)行昆蟲細(xì)胞旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)時(shí)建議使用0.1%pluronic™。F-68pluronic™ F-68(BASF)是一種表面活性,可降低葉輪導(dǎo)致的細(xì)胞膜剪切作用 注:sf-900||SFM和expressFive™ SFM中已經(jīng)含有表面活性劑。
  6. 某些昆蟲細(xì)胞可能需要一定的過程來適應(yīng)懸浮培養(yǎng)。更多信息,請參閱針對具體細(xì)胞的產(chǎn)品說明書或操作手冊。
  7. PS:仟諾生物,您身邊的細(xì)胞生物學(xué)專家,如需相關(guān)產(chǎn)品,敬請電聯(lián)!!
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